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化粪池的工作原理主要基于沉淀和厌氧发酵。生活污水进入化粪池后，经过12至24小时的沉淀，可去除50%至60%的悬浮物。沉淀下来的污泥再经过3个月以上的厌氧发酵分解，使污泥中的有机物转化成稳定的无机物，从而实现污泥的稳定化和无害化。在此过程中，易腐败的生污泥被转化为稳定的熟污泥，污泥的结构得到改变，含水率也相应降低。之后，污泥会被定期清掏外运，进行填埋或用作肥料。
新鲜粪便由进粪口进入池，池内粪便开始发酵分解。因比重不同粪液可自然分为三层，上层为糊状粪皮，下层为块状或颗状粪渣，中层为比较澄清的粪液。在上层粪皮和下层粪渣中含细菌和寄生虫卵多，中层含虫卵少。初步发酵的中层粪液经过粪管溢流至第二池，大部分未经充分发酵的粪皮和粪渣则阻留在池内继续发酵。
生物化粪池通过利用微生物的降解作用来处理污水。在化粪池内，微生物会附着在填料或者池壁上，形成生物膜。当污水流过时，微生物会吸附并分解污水中的有机物，将其转化为无害的物质，如二氧化碳和水。这个过程既能够减少污水中的有害物质，又能达到净化水质的效果。
